多抗親和層析純化
多抗的純化是一件比較簡單的事情，因為人工干預比較大，所以對實驗者的操作依賴性較強。很多新手覺得這是一件比較復雜困難的工作，但是如果理解了原理，就可以自行改進實驗了。多抗純化方法比較多，過去有用鹽析法純化的，有用辛酸-硫酸銨沉淀的方式純化的，也有用冷酒精沉淀的方式純化的，也有后來的離子交換層析和Protein A、G、A/G 純化的，但是在今天，市場上幾乎所有的抗體都是通過抗原親和純化得到的，與其它方法相比，抗原親和層析得到的抗體效率高、產量高、產品純、操作簡單。鑒于很多網友問起這方面的問題，我就詳細地講一講親和純化原理和操作。
說到親和層析，還得從上個世紀60年代說起。當年美國NIH（National Institutes of Health）
有個學生在研究一種酶和抑制劑之間的相互作用的時候，突發奇想：既然此酶可以和抑制劑結合，那如果把抑制劑固定起來，不就可以用來純化酶了嗎？試了一下覺得果然可行于是發了論文，從那之后，就出現了各種各樣的親和層析，親和配基與配體可以是酶與底物、酶與抑制劑、激素與受體、抗原和抗體、糖蛋白與凝集素、生物素與親和素、組氨酸與二價金屬離子、卟啉環與亞鐵離子等。親和層析精髓：將一種分子固定，用來吸附另一種特異性分子，最后將其洗脫下來。
言規正傳，多抗的親和層析是基于抗原與抗體結合的一種層析方式。基本思路是將抗原固定在一種基質（也就是柱的填料，大家都叫介質或beads）上，然后與抗血清孵育以捕獲相應的抗體，然后從基質上洗掉非特異性結合的抗體，最后再將抗體洗脫下來。一個經典的親和純化流程如下：
（1）介質的制備目前大部分親和柱介質都是基于瓊脂糖（Agarose）或者葡聚糖(Dextran)。由于瓊脂糖穩定性好、對蛋白質的非特異性吸附低、適宜活化，因此是制備抗原親和柱介質的理想材料。單純的瓊脂糖是不能和蛋白質直接相連的，因此需要給它加一個有活性的臂，這就有點類似多肽與載體蛋白的偶聯需要一個雙功能試劑一樣。瓊脂糖加臂（活化）的方法比較多，其中涉及的原理也和多肽與載體蛋白偶聯類似，最常用的活化試劑是溴化氰和環氧氯丙烷，另外二溴丙醇、N,N'-羰基二咪唑、雙環氧化物等也可以用來活化瓊脂
糖。
溴化氰對瓊脂糖的活化機理如下：
環氧氯丙烷活化機理如下：
關于如何操作的問題，可以參考文獻。如果你想自己制備，為了你和他人的安全，請不要使用溴化氰活化，溴化氰有劇毒，極微量的攝入都有可能造成死亡，本人對此類事故不負任何責任。如果是單純做一次或幾次小量抗原親和純化，建議購買商品化的介質，GE Healthcare 就有賣的（Cat. NO.為17-0430-01）。以下的介紹就基于此介質說明書展開敘述的。使用此種介質首先需要將其進行預處理，預處理方法是：稱取適量的介質（一般0.5g介質可以一次性純化10ml 左右血清，可以反復使用）倒入pH 2.0 HCl 中，4℃讓其吸脹15min，體積膨脹比例為：1g 可以膨脹至3.5ml，然后將其裝入漏斗中，用pH2.0 HCl 充分洗滌（體積為介質膨脹后的50倍以上）以除去保護劑。千萬不可用中性或堿性試劑洗滌，否則介質會水解。
（2）抗原與介質的連接這一步是整個純化過程中最關鍵的一步，如果在這一步上有什么失誤，建議你從第一步重新開始吧。首先要注意一點：常見的連接方法都基于抗原上的游離氨基或者巰基與活化后的介質的連接，因此體系中不應該有其它含有氨基或巰基的化合物，包括尿素、硫脲、鹽酸胍、Tris、銨根離子、β-巰基乙醇等，如果有這些物質在體系中，應該首先設法除去。
溴化氰活化的瓊脂糖與氨基化合物反應的機理如下：
環氧氯丙烷活化的瓊脂糖與氨基化合物反應的機理如下：
連接反應進行的條件：① 緩沖體系。上述兩個連接反應都應該在堿性環境下進行。pH宜在8-10之間，推薦使用Na2CO3-NaHCO3體系，pH 盡量偏離蛋白的等電點，但不可高于10，否則介質很容易水解。pH 也不能過低，否則抗原的氨基或巰基會被質子化，無法與介質結合。也可以考慮用其它的緩沖體系，但是絕對不可引入帶有游離氨基或者巰基的化合物。為了防止蛋白類抗原的聚集，體系中還可以加入0.5M NaCl 以提高鹽離子濃度。② 蛋白質濃度。為了達到比較快而且比較徹底的反應，抗原濃度應盡量提高（也就是高中課本上講的勒沙特列原理），但過高的濃度有可能造成聚集形成沉淀。一般推薦濃度是5-10mg/ml。需要注意的是介質的承載量并沒有這么大。用來連接的蛋白在緩沖體系中必須完全溶解，如果不能溶解可以嘗試加入去垢劑，多肽等小分子化合物可以用DMSO、DMF、二氧六環助溶。③ 反應溫度與時間。此反應可以在室溫進行，一般來說，室溫4小時反應足夠完成，如果擔心抗原降解，可以在4℃進行，需要過夜反應。
（3）連接效果的評估有經驗的同仁這一步基本可以不做，但是對于新手來說做了這一步心里更有譜一些。這個過程盡量用比較簡單的實驗來做比較好，推薦使用考馬斯亮藍法（Bradford 法），但是體系中如果含有去垢劑，建議改用其它的方法（如BCA、Lowery、凱氏定氮法等），也可以取連接后的上清液（離心后）拿去做SDS-PAGE 判斷。確認連接沒有問題后，以將體系轉入柱子里除去連接后的液體，如果沒有柱子，也可以用離心的方法進行，下同。
（4）多余位點的封閉為了保證連接效率，介質的量通常是過量的，因此連接完后，介質上就有很多多余的空位點，如果不把它們封閉，那接下來的一步里就會與血清中的抗體結合，這樣就會影響抗體得率。含有氨基的小分子化合物都可以用來進行封閉，如尿素、Tris、乙醇氨、單一氨基酸等，大分子物質是不適宜用來封閉的，因為它們的空間位阻會影響下一步中抗體與抗原的結合。封閉條件與連接條件基本類似。封閉完成后，除去封閉液，用PBS洗柱三次。
（5）抗血清與介質的結合血清事先經過10000g 離心5min，有條件的還可以通過0.45μm濾膜過濾。將血清用PBS 稀釋一倍，然后加入連好抗原的介質，密封好，4℃搖晃過液或者室溫搖晃3至4小時，搖晃時最好能顛倒來回搖動，確保所有介質都能懸在液體中。室溫孵育時間不宜過長，否則會引起非特異性吸附，同時影響抗體質量。
（6）非特異性結合的抗體的洗滌第5步完成后，過柱或者離心去掉血清成份，用PBS洗滌三次。然后再用一個稍稍Harsh 一點的體系去洗掉與抗原非特異性結合的蛋白，怎么樣的體系算是比較Harsh 呢？ 一種是偏酸或偏堿一點的pH，可以加酸或加堿將PBS 或生理鹽水的pH 調至偏酸（5.0）或偏堿（8.5）作為洗滌液，用10倍柱體積洗柱一次，也可以直接用150mM Gly，基本不用調pH 就是pH=5.0了。另一種體系是高鹽離子濃度，例如可以在PBS 里加入NaCl 至終濃度為1M，10倍柱體積洗滌一次。兩種體系的本質都是減弱蛋白質分子間的作用力。
（7）洗脫經過第6步的操作后，結合在柱上的抗體就非常純了，同時那些親和力弱的抗體也被洗掉，于是可以開始洗脫了。洗脫方法和上面的洗滌原理基本類似，只是條件更苛刻一點。通常用得比較多的辦法是用pH 2.5左右的HCl（含150mM NaCl）洗脫，也可以采用堿性洗脫液洗脫。洗脫有兩種方式，一種是連續洗脫，另一種是不連續洗脫。前者是連續入加洗脫液，即時監控洗脫情況并隨時決定收集目的抗體組分。不連續洗脫則是分批加入洗脫液，分批收集洗脫流出的成份，最后再對每一次收集的組分檢測。如果用前一種方法，最好有一臺紫外監測儀檢測流出組分以便即時監控，后一種方法的檢測則相對比較簡單一些，只要是可以對蛋白質進行定量的方法都可以使用（如Bradford 法、Lowery 法、BCA 法等都可以），總之就是越簡單越好。洗脫過程盡里在低溫完成，洗脫下的組分應該在冰盒上放置，洗脫下來后的成份應該立即調節pH 至中性，調節pH 應該使用緩沖液，而不應該直接使用強酸或強堿，Na2HPO4、Na2CO3和Tris 等緩沖液是用來作為中和液的不錯選擇。需要指出的是，如果需要將抗體進行偶聯熒光素或者酶的時候，就不能使用Tris 作為中和液，否則會影響后面的邊接效率。
（8）抗體的保存抗體純化完后，必須采取合適的保存，否則很容易就失去活性。總的來說有這么幾個方面需要注意：① 緩沖體系。純化后的抗體必須處于一個相對接近體液的緩沖體系中，一般的PBS 體系就足夠了。注意不要引入高濃度的離子，尤其是金屬離子。不要引入干擾抗體實驗的離子或基團。② 防腐劑。為了防止抗體長菌，必須加入防腐劑，常見的防腐劑有：疊氮鈉、硫柳汞、抗生素（慶大霉素）。疊氮鈉的常用濃度是0.02%，硫柳汞和慶大霉素的常用濃度為0.01%，其中疊氮鈉會抑制HRP 酶活性，因此在需要偶聯HRP酶的抗體中不能加這種防腐劑，而且疊氮鈉會影響細胞色素氧化酶活性，會干擾機體的呼吸作用，因此操作時需要注意安全。硫柳汞對兒童具有潛在毒性，使用時也應注意。③ 穩定劑。向抗體中加入穩定劑可以增加其穩定性，常見的穩定劑有多羥基類化合物（二元醇、三元醇等，如濃度為30%-50%的甘油、乙二醇）、二糖類物質（如蔗糖、海藻糖等）、氨基酸、蛋白質（如BSA 等），如果抗體需要進行標記，則不可以加入氨基酸、BSA 等保護劑。④溫度。長期不用時，抗體應該低溫保存，一般采用-20℃保存。短期不用可以放在4℃，但不要超過一周。抗體絕對要避免反復凍融，前面提到的加入甘油等既可以起穩定作用，還可以起防凍的作用。如果有條件，可以把抗體進行冷凍干燥形成凍干粉，放在-80℃。如果抗體尚未純化，直接以血清的方式保存在-20℃以下，也可以很好地保證其活性。⑤ 濃度。和普通蛋白質一樣，濃度越高就越利于保存。如果抗體濃度太低，可以采用超濾、protein A 或Protein G（操作方法參考單抗純化相關介紹）、透析袋等方式濃縮。超濾的方式操作簡單，直接將抗體裝入超濾管再進行離心即可。透析袋濃縮操作也比較簡單，將PEG（分子量大于8000）配成50%左右的溶液，用合適孔徑的透析袋裝好抗體，然后放入PEG 溶液中攪拌濃縮即可。關于Protein A 或Protein G 濃縮的方法將在單抗純化相關部分講述，需要指出的是這用這兩種親和柱濃縮的損失可能比較大。⑥ 存儲時間。抗體在-20℃并含有甘油的情況下可以存放數年至十幾年（不要反復拿至溫室）。在4℃存放的時間一般在一個月左右就可以有明顯的效價變化。冷凍干燥的凍干粉低溫可放置幾十年。
